
Quello che segue è un test dettagliato eseguito con CombineZP, in cui abbiamo sperimentato lo stack di un insieme di immagini ritraenti un Imenottero Criside (Hymenoptera Chrysididae). La piccola vespa è stata ritratta nella sua caratteristica posizione di difesa, appallottolata su se stessa. Misura circa 4mm di diametro e 2.5mm di spessore.
Abbiamo predisposto un set di ripresa composto dai seguenti elementi:

e cioè:
Nella fase di preparazione abbiamo dimenticato un'operazione fondamentale, che verrà descritta alla fine.
Dopo alcuni scatti di prova per regolare l'esposizione manuale (1/250" con F/4) e il bilanciamento del bianco rispetto alla temperatura di colore delle lampade, abbiamo iniziato ad acquisire le immagini visualizzandole a monitor grazie alla funzione di remote capture (acquisizione remota) consentita dal software Canon EOS Utility. Nonostante la possibilità di comandare lo scatto dal software, abbiamo preferito usare lo scatto flessibile, per ridurre al massimo le vibrazioni indotte al sistema (stativo e computer giacevano sullo stesso tavolo). Prima di ogni scatto abbiamo controllato il fuoco con il mirino angolare. Nonostante il basso spessore dell'esemplare (~2.5mm) abbiamo acquisito un numero elevato di immagini in formato RAW, per sicurezza.
Trasciniamo le immagini RAW in Photoshop: queste vengono aperte dal plugin Adobe Camera Raw. Esaminiamo le immagini e ne eliminiamo alcune. Avendo tutte le immagini gli stessi parametri di ripresa (esposizione, illuminazione, posizione), decidiamo di selezionarle tutte (Select all) e di applicare le operazioni di:
Mantenendo la selezione su tutte le immagini, le esportiamo in formato JPEG al massimo della qualità. Scorriamo poi i JPEG per percepire gli scostamenti fra uno scatto e l'altro. Le differenze prospettiche fra il primo e l'ultimo scatto sono notevoli e tali da farci dubitare sulla possibilità di allineare immagini così differenti fra loro (l'animazione che segue è una gif animata in cui i colori sono stati ridotti a 256):

Decidiamo quindi di eliminare dalla nostra sequenza il primo e l'ultimo scatto, riducendo l'insieme a 17 immagini:

Sono ben visibili differenze di bilanciamento del bianco fra i vari scatti: evidentemente le nostre luci non hanno un'emissione costante, anche se hanno dimostrato il grande pregio di non indurre riflessi sovraesposti su di un soggetto intrinsecamente riflettente - e quindi difficile - come quello ritratto.
Lanciamo il software CombineZP e col pulsante New carichiamo la sequenza di immagini. Al termine del caricamento, CombineZP ci mostra la prima immagine. Selezioniamo dal menu a tendina Align and Balance Used Frames e premiamo GO:

Al termine dell'allineamento (*** Finished Executing Align and Balance Used Frames Macro ***), selezioniamo dal menu a tendina Do Stack e premiamo GO:

Al termine dell'operazione di stack (*** Finished Executing Do Stack Macro ***) rimaniamo ammirati davanti al risultato:
Sperimentiamo subito anche altri metodi di stack: "Do Weighted Average Macro":
e "Pyramid Do Stack Macro":
E' possibile scaricare le 3 immagini non compresse (ZIP da 4MB).
Importiamo in Photoshop i tre risultati per confrontarli al 100%. Con i metodi "Do Stack" e "Pyramid Do Stack" - che sono quelli generalmente utilizzati - sono ben visibili dei vistosi artefatti attorno al soggetto, in forma di aloni ("halo"), al contrario del metodo "Do Weighted Average", che non ne ha prodotti.
D'altra parte, notiamo che il risultato ottenuto col metodo "Do Weighted Average" è molto più "morbido" rispetto agli altri: i dettagli fini (es. pubescenza) sfumano e la gamma tonale ci appare notevolmente più ridotta:
Decidiamo quindi che l'immagine più accettabile è la "Do Stack". La portiamo in Photoshop per effettuare alcune correzioni. Innanzitutto, correggiamo il contrasto, a nostro avvisto eccessivo (Image > Adjustments > Brightness/Contrast). Dopodiché decidiamo di correggere tramite fotoritocco gli artefatti. Purtroppo, ingrandendo al 400%, notiamo la presenza di altri artefatti, ben peggiori dei precedenti e proprio sulle ali e sulle zampe del soggetto:

Su questo tipo di artefatti capiamo che, purtroppo, si potrà fare ben poco. Sugli artefatti esterni al soggetto, invece, effettuiamo una correzione manuale tramite pennello, per uniformare le zone affette rispetto allo sfondo. Poi selezioniamo lo sfondo con la bacchetta magica (Magic wand), impostata ad un valore basso di tolleranza per non rischiare di includere anche le parti marginali del soggetto. Teniamo premuto shift da tastiera per sommare le selezioni. Una volta selezionato tutto lo sfondo, sempre col pennello lo rendiamo uniforme:

Stack fotoritoccato sullo sfondo
Se desideriamo uno sfondo bianco, apriamo il controllo dei livelli (Image > Adjustments > Levels) e spostiamo il cursore del bianco verso sinistra fino al picco che segna la posizione delle zone chiare dell'immagine sulla scala dei livelli da 0-255:

In tal modo il nostro sfondo passa da grigio-viola (RGB = 207,201,206) a quasi bianco puro (RGB = 255,250,255):

Questa correzione dei livelli, però, non è selettiva sullo sfondo, ma è estesa a tutta l'immagine, quindi ha interessato anche il soggetto. Per escludere il soggetto dalla correzione, si può operare in due modi: una sbrigativa riduzione della luminosità globale (Image > Adjustments > Brightness/Contrast); oppure, un'operazione di History Brush:
Visivamente non è immediato comprendere che cosa succede: non si sta cancellando il soggetto, ma l'effetto della correzione dei livelli dal soggetto. Quindi, rispetto alla correzione della luminosità, la History Brush è un metodo più preciso e rigoroso. Ecco l'immagine finale:

Stack definitivo dopo il fotoritocco con Photoshop
Siamo rimasti sconfortati dalla presenza degli artefatti prodotti dal metodo "Do Stack", che ci hanno obbligato ad un lavoro di fotoritocco non indifferente. Per non parlare degli artefatti sul soggetto, che abbiamo dovuto accettare passivamente. Approfondiamo la questione.
L'help del programma riporta una spiegazione che suona così: la presenza di artefatti dipende dal tipo di immagini sottoposte a stack e dal metodo di stack usato. Compaiono nelle porzioni di ogni immagine caratterizzate da poco - o nessun - dettaglio [quindi come quelli dello sfondo]. Gli artefatti sono a volte inevitabili e devono essere corretti con un software di fotoritocco.
Rifacciamo la procedura di stacking con un numero inferiore di immagini, prendendo solo le immagini dispari e riducendo quindi il set a 9 immagini:

e ottenendo il seguente risultato:
Esaminato al 100% (ZIP 1MB), questo stack non differisce particolarmente da quello ottenuto sul set completo di immagini. E, anzi, gli artefatti attorno al soggetto sono sfumati e poco fastidiosi. Ingrandendo al 400% l'ala dell'imenottero notiamo con piacevole sorpresa che gli artefatti sono sì presenti, ma decisamente ridotti e più accettabili rispetto al test su 17 immagini:

Questo ci porta a considerare che è bene individuare il numero ottimale di immagini da sottoporre a stack, senza eccedere in difetto o in eccesso. Tutti i tempi - di acquisizione e di postproduzione - si potrebbero così ridurre, ma soprattutto si ridurrebbero gli artefatti. Il problema è: qual è il numero ottimale di immagini?
Innanzitutto è solo con dei test approfonditi che ognuno riuscirà ad individuare la combinazione di strumenti, illuminazione, tecniche fotografiche e procedimenti software più consona alle proprie esigenze, e quindi adatta a costruire un proprio protocollo operativo. L'eccesso di contrasto e la presenza di artefatti sono correggibili, ma è necessario leggere i manuali e gli articoli online e, soprattutto, sperimentare.
Il test effettuato ha rivelato un grosso limite nelle luci hobbystiche in nostro possesso: non hanno un'emissione costante e la temperatura di colore varia. La fotografia è luce, quindi l'aspetto dell'illuminazione è assolutamente critico. Vanno acquistate luci buone, con parametri costanti e noti da valutare attentamente. Esistono oggi illuminazioni molto affidabili specifiche per gli acquari, a 4200°K o anche a luce fredda (6500°K). In ogni caso, al di là delle schede tecniche ufficiali delle varie lampade, è sempre bene effettuare un bilanciamento del bianco preventivo della fotocamera con le luci in uso.
La scelta del software stesso è un aspetto fondamentale. Non tutti possono permettersi di acquistare i software a pagamento, così come non tutti si trovano bene con quelli free/open source, che spesso presentano bug o procedimenti macchinosi. Va comunque trovato il software giusto per i nostri scopi e per il nostro hardware. Con i software sbagliati si rischia di sottrarre tempo alla fase fotografica vera e propria.
Il numero teorico di immagini che è necessario acquisire per comporre uno stack e limitare il rischio di artefatti è dato dallo spessore del soggetto diviso per la profondità di campo dell'obiettivo a quell'ingrandimento e a quel diaframma di lavoro. 
La mossa giusta da fare è fotografare un decimetro millimetrato per comprendere la profondità di campo del nostro obiettivo all'ingrandimento e al diaframma prescelti. Se, ad esempio, la profondità di campo misurata del nostro obiettivo macro ad un rapporto di ingrandimento di 1:1 e con diaframma F/4 si rivelasse di 1mm, allora il numero teorico di scatti sarebbe lo spessore del soggetto (in mm) ÷ 1 (mm) = spessore del soggetto in millimetri. Nel caso dell'imenottero che abbiamo fotografato, spesso 2.5mm, il numero di scatti teorico per effettuare uno stack sarebbe di 2.5, quindi 3.
Però, col numero teorico di scatti il "salto" prospettico fra uno scatto e quello successivo sarebbe troppo netto. Riteniamo quindi che, per garantire la massima gradualità prospettica, la massima copertura dello spessore del soggetto e il minimo numero di scatti possibile, lo stack ottimale sia dato dallo spessore del soggetto diviso per ½ PdC. Quindi, nel caso dell'imenottero di 2.5mm di spessore, il numero di scatti ottimale sarebbe pari a 5.
Purtroppo, però, siamo dubbiosi sulla nostra capacità di spostare l'obiettivo dal soggetto in passi perfetti di 1 PdC o di ½ PdC ognuno, quindi non possiamo fare altro che rimetterci alle nostre abilità manuali.
All'inizio della pagina abbiamo detto di aver dimenticato un'operazione fondamentale: la pulizia del soggetto. Tutte le immagini qui illustrate, infatti, rivelano dei peli di polvere sull'addome dell'esemplare. Inizialmente non ci eravamo accorti di quella polvere, che si è rivelata solo osservando le immagini acquisite. Nell'immagine su sfondo bianco abbiamo tolto la polvere tramite lo strumento Timbro (clone stamp), ma non è questo il metodo corretto: la polvere non deve essere presente. Ecco perché è fondamentale pulire il soggetto prima delle riprese, con un pennellino sottile al di sotto di una lente o di un microscopio stereoscopico.
Per approfondimenti di tipo operativo è utile l'articolo A Guide to Digitizing Insect Collections Using MANTIS and Following the Protocols of the Harvard MCZ Entomology Type Image Project, di Sarah Ashworth and Jennifer Fogarty, reperibile in PDF o in DOC. L'articolo sta alla base del protocollo americano di digitalizzazione delle collezioni entomologiche della Harvard Entomology, che va sotto il nome di E-Type Initiative.
Questa tecnica ci attira particolarmente, dal momento che integra macrofotografia, entomologia ed elaborazione digitale. Abbiamo intenzione di approfondirla al massimo anche grazie al contributo dei lettori. Per questo, è nostra intenzione creare un argomento specifico nel Forum del sito.
Per citazioni
Gian Luca Agnoli, Manuale di Fotografia Chrysis.net, URL: http://www.chrysis.net/photo/.